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同位素标记在药物研发过程中的应用

作者:来源:药渡 作者:东华帝君 日期:2020-08-06 13:47:09 点击数:

记得,同位素、同位素标记这些词汇首次被输入进大脑,可追溯到少时学习“光合作用”的年代...是啊,我们曾经学了那么多东西,真正能用到日后工作中的,又能有多少?而这众多的“知识点”,倘若能在日后有所接触,就已经十分不易了...曾经的同位素标记,告诉了我们“光合作用中释放的氧到底是来自于水,还是来自于二氧化碳”,而今天工作中的同位素示踪,又能告诉我们哪些信息呢?而我们又需要了解哪些与药物相关的同位素信息呢?笔者作为一名药物合成人员,作了如下归纳总结,希望能对君有益!

同位素简介

同位素为相同化学元素的原子,由于在原子核中存在不同的中子数而具有不同的质量,有轻、重同位素之分;根据物理特性,又可将同位素分为放射性和稳定性两种形式。放射性同位素(如:3H、14C)经历着自身的衰变过程,并放射出辐射能,是不稳定的,具有物理半衰期;稳定性同位素无放射性,物理性质稳定,以一定比例(丰度)存在于自然界,对人体无害,可采取化学合成的方法将其标记到药物分子中去,并通过气质、液质等仪器对其进行跟踪检测。

同位素标记在药物研发过程中的2个主要方向

药代动力学研究

在定量分析灵敏度方面,放射性同位素标记化合物要高于稳定同位素标记物,且放射性的测量不受非放射性杂质和化学状态的影响,因此定量分析更加简便,分析结果更加准确。放射性同位素标记化合物除了用于解决常规分析方法无法解决的分析难题,更重要的是可用作示踪剂,从而来研究药物在体内的分布、代谢、疗效、作用机制等,为药物的药代动力学研究提供重要的依据,同时为创新药物的研发提供方法。

毒性研究

潜在毒性研究是药物的发现和临床过程中必须进行的一个环节,以往的毒性研究多采用对大量的化合物进行体外实验和动物实验,需要花费大量的金钱和时间,且对毒性产生的机理也无法解释。使用稳定同位素标记的化合物可以追踪药物的代谢过程,找出毒性产生的原因,并能预测新化合物潜在的毒性。

放射VS稳定简述

放射性同位素标记

放射性同位素得以广泛应用于活性物质示踪主要依赖于其最重要的两个特点:1)是与被示踪的物质有同一性,即放射性核素与其同种元素的非放射性核素在化学和生物学行为上具有高度一致性,不致扰乱和破坏体内外生理过程的平衡状态;2)是与被示踪的物质有可区别性,放射性核素的原子核不断衰减,发出能被放射性探测仪所探测的射线,从而实现对标记物的定量及定位。此外,放射性同位素示踪技术还具有灵敏度高、专属性强、适用性广、检测方法简便等优点,因此在药物ADME研究中得到了广泛的应用,且美国FDA早已将放射性同位素标记药物给药后的药动学数据作为新药安全性评价的重要依据,并制定了相关指南。

稳定性同位素标记

稳定同位素标记试剂较放射性同位素标记试剂而言,最主要的优点在于无放射性、无需复杂的放化设备及防辐射防护措施,且无环境污染。目前,在我国国内已完成了15N、18O、20Ne、22Ne、13C等稳定同位素分离技术的研究,并逐步将稳定同位素标记试剂的制备和检测技术进行国产化研发,从而打破国外垄断。

示踪剂如何选择

放射性同位素示踪剂

在药物ADME的研究中,常用的放射性同位素包括14C、3H、32P、33P、35S、125I、131I等。随着小型PET仪器的发展,利用11C、13N、15O、18F等放射性核素进行ADME研究的实例也日渐增多。在放射性示踪剂的选择上,应根据实验目的、实验周期以及操作者安全等几方面综合考虑,包括所选放射性同位素的射线类型、半衰期、放射化学纯度、比活度、毒性及标记位置等。常用的放射性示踪剂多为单一放射性同位素标记的化合物,有时为了实验的特殊需要,也可以采用双标记或多标记的放射性物质,但此时选用的标记原子最好是不同能量或发射不同类型射线的核素。常见的有14C/3H、14C/125I、125I/131I等。

低能量的14C和3H是药物ADME研究中最常用的2种放射性核素,这2种核素的半衰期分别为5730年和12.35年,由于其半衰期长,在实验周期中测得的数据一般不需要作物理半衰期的校正,便于测量及结果计算。再者,14C和3H两种元素发射的β-射线能量较低,易于防护,并可用液闪技术测得,实验操作及结果检测十分方便。此外,14C和3H还可通过放射自显影技术进行检测,显影清晰,这又进一步扩大了这2种核素的标记物在ADME研究中的应用。

稳定性同位素示踪剂

药学领域常用于示踪的稳定性同位素,主要为2H、13C、15N、18O。严格来讲,稳定性同位素是指某元素中不发生或极不易发生放射性衰变的同位素,如12C和13C均是碳的稳定性同位素,且在代谢研究中,“稳定性同位素”常用来表示天然丰度比较低的那一种稳定性同位素。碳在自然界中主要以12C的形式存在,13C仅占1.11%,氮元素则以14N为主,15N仅占0.37%。

标记位置的选择

在制备标记药物前,首先要选好合适的同位素作为标记元素并决定标记的位置。作为示踪研究用的标记药物要使标记的原子尽量能代表该药物整个分子在生物体内的作用,并且要注意到药物在体内可能发生的变化。在选用作为标记原子的同位素时应考虑到药物分子的结构,同位素的半衰期,射线的能量,是否易把标记原子引入以及示踪试验的特殊要求等因素。最常用的同位素有14C、3H和35S;有时也采用32P、131I。

14C作为最常用的放射性核素通常标记在分子的骨架结构上,其标记位点较为稳定;3H易与周围环境中的1H发生交换,导致比活度下降,因此稳定性不如14C;此外,3H相对于14C来说有较明显的同位素效应,也在一定程度上限制了其应用。不过在一般的示踪实验中,由同位素效应引起的误差常在实验允许误差内,可忽略不计。此外,考虑到3H标记物的合成较为简便,因此在3H标记物能够满足实验需求的情况下,也常选用3H标记物作为示踪剂。

除以上,在标记位点的选择时,还可利用计算机辅助代谢物预测技术(CAMP)预测化合物分子结构中的稳定部位。一般来说,应首先考虑对分子结构中的芳香环或脂环上的C原子进行标记,而尽可能避免在羧基、羟基、巯基、氨基、亚氨基等活性部位进行标记。因为一旦这些不稳定基团脱离母体化合物,就失去了对母体药物及主要代谢物的示踪的能力。此外,标记位点还应远离化学键断裂位置,以避开同位素效应的影响。如果母体化合物在代谢过程中因化学键断裂同时生成2个重要代谢产物,在母体化合物标记时可考虑采取双标记技术。

同位素标记试剂的化学合成

放射性同位素标记试剂的合成

放射性化合物的合成制备,受限于其有限资源和高昂的费用,因此一般新药进入实质性研发阶段才采用放射性标记化合物进行示踪研究。放射性化合物在药物研发中的应用多数倾向于限制在临床前或临床研究阶段。而进入临床前和临床研究阶段之前的相关研究中通常可用直接氚化等新技术,如用氚水、氚气、氚复合物以及近期发展起来的氚化试剂等目标化合物分子中直接引入氚原子,得到简单的非定位氚标记目标化合物,而不必进行放射性合成方法进行定位标记。此类方法有一定缺陷,如在体内易于与体内的氢原子交换而导致原药及其代谢产物失去放射性。但此类非定位标记方法有着放射性示踪物易于标记,技术手段简单、经济等特点,而且足以完成新药研究初期目标物质在体内外大致定性和定量目的。但新药研究后期,化合物在体内ADME研究、代谢动力学研究及物料平衡研究等深入确切的定位定量,甚至进一步进行代谢产物的定性定量研究中需要稳定的定位标记化合物来完成。因此,用化学合成方法将新药目标化合物中代谢稳定基团的C,H,I,F 等元素用14C,3H,125I,18F等放射性元素进行对应标记合成。标记合成一般采用含有放射性元素的简单化合物,如3H2,14CO2,Na125I 等,在药物合成的适当步骤中引入,并在制备操作、分离、分析时均需微量或超微量技术。

稳定性同位素标记试剂的合成

化学合成法合成稳定同位素标记有机或无机类试剂通过选择合适的合成路线,设计适合实验室规模实施的精密合成装置和高效催化剂以及特殊精制纯化装置的设计、制造,使得原本在工业条件下合成的多种稳定同位素标记试剂得以在实验室的温和条件下高收率、高质量的完成制备。稳定同位素标记试剂的合成策略不仅要考虑纯度和收率,更多的需要考虑工艺过程对目标产物丰度的影响。因此,需要根据目标产物的定位标记选择合适的同位素原料,充分考虑合成环境对丰度影响因素等问题。例如,有机合成法制备稳定同位素13C标记试剂,合成路线的设计、空气中CO2的影响、甚至设备材质的成分都会对13C同位素的丰度产生明显影响,在合成稳定同位素D标记试剂时,空气中微量的水分可能会对目标化合物的丰度产生较大的影响,制备过程中用到的大量含H元素的无机或有机试剂,也可能会对合成的D标记试剂的同位素丰度造成稀释。

稳定同位素标记基础试剂在稳定同位素标记试剂的化学合成中起着关键和决定性作用。通常情况下,稳定同位素的基础原料是 H15NO3、13CO和 D2O,以有限的稳定同位素基本原料来合成稳定同位素标记基础试剂,因而也就使得该类试剂的合成难于普通试剂。如13C或D标记甲醇的制备,常规甲醇的制备已是非常成熟的工艺,采用中高压反应设备和工艺,条件复杂、单程转化率低,需将CO气体循环利用来得到高收率和高纯度的甲醇,这样的工艺完全不适合13C或D标记甲醇的合成。13C或D标记甲醇的合成是通过设计精密的催化加氢反应器和精馏装置,以13CO 或 D2O为原料,添加自制的 Cu-Zn-Cr催化剂,采用精细控制的工艺条件,可使同位素原料的利用率达90%以上。又如15N标记水合肼的合成过程中,虽然参考了工业化水合肼的工艺过程,但为了提高稳定同位素原料尿素-15N2的利用率,除改变了反应所需的催化剂外,还对工艺条件进行优化,从而使15N同位素利用率达75%以上。13C、D标记的乙炔、苯、碘甲烷是引入稳定同位素标记基团的重要基础试剂,制备的基本原则不仅要考虑同位素基础原料的充分利用,同时要考虑合成产物的同位素丰度要达到99 atom%以上。

感悟

之所以总结以上内容,源于最近项目的进展。讲真,新药合成,这条路不易(当然,整个新药研发链都不易...)。曾几何时,药物化学大部分工作都是在干化学,而如今,化学已仅仅成为了拿到目标化合物的一种手段而已。工作中,我们的精力不得不均分到各个学科当中(如药理、毒理、质量、制剂...),否则,学科间相互讨论的时候,就尴尬了,且不利于项目的整体了解与把控。不过,虽然每天焦头烂额、脚打后脑勺的忙碌,但这条道路却又能带来分外的充实,因为它不仅可以离科学更近一些,且倘若开花结果,是可以为无数的病患带来健康和希望的。故每当想到于此,努力让自己成为一名传承中的“种树人”,再苦再累,又有何不可呢!

参考文献:

    1. Can stable isotope mass spectrometry replace nullradiolabelled approaches in metabolic studies? http://dx.doi.org/doi:10.1016/j.plantsci.2016.05.011

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    3. Stable isotope compounds - production, detection, and application. Biotechnology Advances, In press, corrected proof, Available online 19 January 2018.

    4. The use of stable isotopes in the study of human pathophysiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, Volume 93, December 2017, Pages 102-109.

    5. Stable isotope-resolved metabolomics and applications for drug development. Pharmacology & Therapeutics, Volume 133, Issue 3, March 2012, Pages 366-391.

    6. The Use of Isotopically Labeled Compounds in Drug Discovery. Annual Reports in Medicinal Chemistry, Volume 44, 2009, Pages 515-534.

    7. 蛋白多肽类药物药代动力学分析方法研究进展. CNKI

    8. 稳定性同位素标记试剂的研发及应用展望. CNKI

    9. 放射性同位素标记药物的制备方法.CNKI



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