19世纪末，由于电子、X射线和放射性的发现，使人类的认识能深入到原子内部。通过对放射性的研究，不仅发现了钋、镭、锕等放射性元素，还从这些放射性元素中分离出30多种新的放射性“元素”，多到周期表中没有可以容纳它们的空位，而且有些放射性不同的新元素在化学性质上完全相同，彼此无法分开，以致在当时引起怀疑：周期表对放射性元素是否适用？
通过对这些事实的进一步研究，1913年索迪和法扬斯同时发现放射性元素位移规律，并提出同位素的概念，从而解决了许多新元素在周期表上的位置问题，并用同位素概念说明了它们之间的依存变化关系。
1913年汤姆逊和阿斯顿在用磁分析器研究氖时，发现了氖的两种同位素—氖20和氖22。这是第一次发现稳定同位素。1919年阿斯顿制成质谱仪，随后他在71种元素中，发现了202种同位素，并测定了各同位素的丰度。1920年赫维西和策希迈斯特尔研究了同位素交换反应。1931年尤里等发现重氢；1933年路易斯等用电解法制得纯重水；1934年挪威利用其廉价水电能建立了第一座重水工厂。1942年美国建造了电磁分离器并分离出铀235；1943年美国又建立了三座六氟化铀气体扩散工厂生产铀235；1944年美国橡树岭国家实验室首先生产了千克量的铀235，并制造了第一颗原子弹。重水既是建造反应堆的重要原料，又是热核燃料和热核武器的原料。第二次世界大战后，一些国家竞相研究生产重水的新方法，其中硫化氢双温交换法、液氢精馏法等都实现了工业化生产。
从20世纪50年代开始，为了寻找更好的同位素分离方法，不断把科学技术新成就应用到同位素分离技术中。例如，60年代的色谱法和70年代开始的激光法分离同位素的研究，都取得了突破性进展。到50年代中期，世界上用同位素分离法生产的同位素主要有：氘、氚、氨3、锂6、硼10、碳13、氮15、氧18和铀235等。其中，重水的年产量以千吨计。随着核科学技术的发展，特别是核武器的研制和核电站的发展，更加推动了同位素化学的发展。